周恩来离开国民革命军第一军后,集中力量主持中共广东区委军委的工作。那时两广已经统一,已处在大举讨伐北洋军阀的北伐战争前夜。放在广东区委军委面前最重要的课题,便是为北伐战争做好准备。
当时广东区委军委直接领导7个单位的党的工作:国民革命军第一、二、三、四、六军、黄埔军校本部和入伍生部。周恩来每星期都要召集他们开一两次会议,听取他们的汇报,部署各项工作。

聂荣臻、黄锦辉同这些单位经常联系,向这些单位派遣干部,向军中的共产党员传达党的方针政策,积极为北伐战争做准备。作为广东区委军委的负责人,周恩来还帮助过广州国民政府军事总顾问加伦将军制订北伐的军事计划。
1926年5月,叶挺率领的国民革命军第四军独立团作为北伐先遣队,从肇庆、新会出发,开赴湖南前线。叶挺独立团是在周恩来的努力下,于1925年11月组建起来的,全团2100多名官兵。这是一支由共产党直接领导的,以共产党员、青年团员为骨干的革命武装。刚成立时,全团有共产党员20人左右,建立了党的支部。
独立团出师经过广州时,周恩来在叶挺家里召集团内连以上党员干部开会,向他们分析国内外形势,北伐的有利条件,湖南、湖北的工人、农民、学生运动的情况,唐生智部的情况,广东各军的情况,说明独立团担任北伐先遣队的任务。并且提出几点要求:
一、加强党的领导,加强政治工作;
二、注意发动群众,组织群众;
三、注意统一战线工作,很好与友军团结;
四、作战要勇敢,要有牺牲精神,要能吃苦耐劳;
五、要起先锋作用、模范作用、骨干作用;
六、现在有些军队都不愿意派部队先出去,只要你们打了胜仗,他们就会跟上来。
最后,周恩来用“饮马长江”这四个字来鼓励大家。临走时,同每个同志一一握手,说:“武汉见面。”先遣队出师前,周恩来对独立团党支部的一番细致深入的指导,对全团起了巨大的鼓舞作用。在之后的北伐战争中,从进入湖南到攻克武昌,叶挺独立团一直充当前锋,英勇善战,屡建奇功,为国民革命军第四军赢得了“铁军”的光荣称号。
周恩来还在国民革命军总政治部举办的战时政治训练班上作了题为《国民革命军及军事政治工作》的讲演。他在这篇讲演中系统地总结了军队政治工作的经验,指出:“我们做政治工作的使命,对于官长官佐要巩固其革命观念,对于士兵要使之有革命常识。”“最近国民革命军唯一的使命就是反帝国主义。这个问题解决,就可消灭军阀及平息社会上一切不安的现象。
所以,我们在革命军里做政治工作,最要紧的是使广大的群众明了帝国主义的罪恶,这是政治工作最近的目的。”他具体地论述了军队中政治工作的范围和方法,并且指出:“我们是为主义为党国而奋斗的。我们在军队里做政治工作,要以身作则,严守纪律,常常表示勇敢的态度,比士兵更要勤苦。”他指出,这样才能鼓起士兵们作战的勇气,得到人民的支持,巩固革命的基础。当北伐军准备出发的时候,周恩来所作的这个系统的讲演,对北伐军中的政治工作人员弄清楚自己工作的要求和方法是有帮助的。

1926年7月9日,国民革命军八个军,共10万人,在广州正式出师。直接讨伐的对象是受帝国主义支持的直系北洋军阀吴佩孚部和孙传芳部。在各地群众的热烈响应下,轰轰烈烈的北伐战争开始了。北伐时,周恩来没有随部队一道进军武汉,但在战争进行过程中,他主持下的广东区委军委做了大量的领导工作。就这样,从1926年下半年到1927年3月,北伐军只用大半年的时间,就消灭了军阀吴佩孚和孙传芳的军队,把革命从广东推进到长江流域,占领了湖南、湖北、江西、福建、浙江、安徽、江苏等省,严重地动摇了帝国主义及其走狗北洋军阀在中国的统治。
北伐战争之所以取得很大的胜利,原因很多。首先因为这是一场反帝反封建的正义的革命战争,是国共两党合作的成果,因而得到沿途广大工农群众的有力支持,当然也有苏联顾问的帮助和苏联政府物质上的支援。其次,归功于周恩来近两年来在黄埔军校和国民革命军中进行的卓有成效的政治工作。它使军队中许多指战员有着明确的革命目标和不怕牺牲、英勇作战的革命精神。在北伐军中共产党员和青年团员发挥了模范先锋作用。
随着北伐战争的节节胜利和工农群众运动的迅猛发展,国民政府和国民革命军内部原来存在的矛盾越来越尖锐地表现出来。已就任国民革命军总司令的蒋介石反对革命的面目也更加清楚地暴露出来。周恩来清醒地看到这一切,并以无产阶级革命家的大无畏气概和光明磊落的胸怀,坚定不移地维护革命力量的团结,旗帜鲜明地回击了国民党右派的污蔑和攻击。
对蒋介石的反共分裂行径,许多共产党人为挽救中国革命主张对反革命进行反击,但中共党内以总书记陈独秀为代表的右倾机会主义者一直持迁就让步的态度,认为反击就会导致统一战线破裂。这就更加助长了国民党右派的反动气焰,蒋介石和汪精卫先后发动“四一二”反革命政变和“七一五”反革命政变,大肆屠杀共产党员和革命群众。国共合作所发动的国民革命就此宣告失败。
1927年年底,周恩来奉命调中共中央工作,离开他工作了两年多的广州。在这个时期,周恩来在统一战线、武装斗争、党的建设等方面做出了创造性的贡献,为后来中国革命的发展奠定了一个坚实的基础。
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